Синтез олигонуклеотидов осуществляется на автоматическом синтезаторе амидофосфитным методом. Суть метода заключается в последовательном наращивании олигонуклеотидной цепи соответствующим активированным мономером. Уровень чистоты целевого олигонуклеотида определяется эффективностью присоединения мономера к полинуклеотидной цепи на каждой стадии синтеза.

    Амидофосфитный метод позволяет проводить конденсацию на каждой стадии в среднем на 98.5%. Таким образом, для N-звенного олигонуклеотида необходимо провести N циклов присоединения нуклеотида к растущей олигонуклеотидной цепи, а значит, конечный выход продукта будет равен:

ПОМНИТЕ! Чем длиннее Ваш олигонуклеотид, тем более необходима его очистка.

    Присоединение мономера к полинуклеотидной цепи на каждой стадии синтеза, как и любая другая химическая реакция, не протекает количественно, поэтому, в конце синтеза помимо целевого олигонуклеотида необходимой последовательности и длины накапливаются более короткие продукты.

    Основная цель очистки заключается в удалении образующихся в процессе синтеза укороченных последовательностей и выделении олигонуклеотида целевой длины. "Синтол" для очистки олигонуклеотидов использует гель-электрофорез или ВЭЖХ. Условия очистки подобраны в соответствии с длиной, последовательностью и природой олигонуклеотида для обеспечения максимального разделения продуктов синтеза. Мы можем гарантировать 90-98% чистоты для всех олигонуклеотидов, которые Вы заказываете у нас.

    Таким образом, для того, чтобы выбрать между неочищенным или очищенным олигонуклеотидом, необходимо знать, как повлияет примесь укороченных последовательностей на прецизионность эксперимента.

    Здесь приведены некоторые данные, связанные с выбором уровня чистоты олигонуклеотида, допустимого для разного рода экспериментов.

    Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) - это широко используемый метод анализа и очистки олигонуклеотидов после синтеза. Сюда входят четыре основные стадии: пробоподготовка, электрофорез, визуализация продуктов разделения и выделение целевого вещества.

    Разделение олигонуклеотидов под действием электрического тока происходит в зависимости от молекулярного веса и длины образца. При этом олигонуклеотиды, содержащие так называемые мигающие нуклеотиды, в процессе гель-электрофореза не разделяются.

    Препаративная электрофоретическая очистка олигонуклеотидов производится в 10-20% полиакриламидном геле в зависимости от длины олигонуклеотида, т.е. в условиях максимального разделения продуктов синтеза. Разделение ведется в денатурирующих условиях (7 М мочевина) для того, чтобы предотвратить образование олигонуклеотидом вторичных структур. Разделение в присутствие маркеров длин позволяет точно идентифицировать олигонуклеотиды целевой длины.

    Визуализация геля производится на ТСХ пластине под УФ-лампой. Этот метод детекции позволяет различить олигонуклеотиды, количества которых превышают 0.1 ое.

    Олигонуклеотид целевой длины вырезается из геля, выделяется и обессоливается. Измерение концентрации олигонуклеотида производится с использованием двулучевого УФ-спектрофотометра при длине волны 260 нм в области максимального поглощения олигонуклеотида.

    Электрофоретическая очистка олигонуклеотидов позволяет достигнуть 95-99% чистоты для коротких олигонуклеотидов (<25 звеньев) и 85-90% - для длинных (>30 звеньев).

ПОМНИТЕ!
- Очистка в ПААГ может быть использована только для небольших количеств олигонуклеотидов (до 10 ое).
- Олигонуклеотиды, содержащие большое количество гуанина, склонны к образованию высоко стабильных вторичных структур, не разрушающихся даже в 7М мочевине, и поэтому эффективность очистки для таких G-богатых олигонуклеотидов значительно снижается.

    Целевой олигонуклеотид на последней стадии автоматического синтеза несет на 5'-конце сильно гидрофобную диметокситритильную группу, обеспечивающую легкость выделения его с помощью обращенно-фазовой высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Примеси олигонуклеотидов меньшей длины, не несущие этого гидрофобного остатка, таким образом, отделяются от олигонуклеотида требуемой длины.

    Принцип метода основан на разделении молекул различной гидрофобности, содержащих и не содержащих диметокситритильную группу. Хроматографическая колонка с гидрофобным носителем адсорбирует оба типа молекул. Однако более гидрофобные молекулы удерживаются на колонке дольше, чем менее гидрофобные при элюции градиентом буфера.

    После выделения целевого олигонуклеотида диметокситритильная группа удаляется, а олигонуклеотид обессоливается. Чистота хроматографически очищенного олигонуклеотида подтверждается далее с помощью аналитического гель-электрофореза.

    Обращенно-фазовая ВЭЖХ позволяет получить большие количества очищенных олигонуклеотидов. При этом возможная степень очистки составляет 90-95%. Вместе с тем, при очистке олигонуклеотидов, длина которых превышает 50 звеньев, эффективность разделения продуктов синтеза может значительно снижаться.

ПОМНИТЕ! G-богатыми олигонуклеотиды, склонные к образованию высокостабильных вторичных структур, не могут быть выделены с помощью этого метода.