Метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) стал в настоящее время признанным стандартом при исследовании ДНК и РНК. Он позволяет определять кинетику реакции и на основе полученной информации судить о наличии и исходном количестве ДНК-мишени в образце. Кроме того, метод ПЦР-РВ позволяет определять известные мутации в последовательности ДНК и их процентное содержание. Важным достоинством метода является отсутствие необходимости в пост-реакционных манипуляциях с образцами и, как следствие, снижение риска контаминации, сокращение времени анализа и упрощение организации ПЦР лаборатории.

Зонд для ПЦР в реальном времени является важным компонентом реакционной смеси. Он представляет собой олигонуклеотид к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. Последовательность зонда подбирается таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами.

Флуоресцентные красители (флуорофоры) - это молекулы, которые при поглощении фотона испускают свет с большей длиной волны (т.е. флуоресцируют). Существует большое число флуорофоров, отличающихся по спектру флуоресценции.

Гаситель флуоресценции - молекула, спектр погощения которой лежит в области длин волн спектра испускания флуорофора. Тушение флуоресценции происходит благодаря безызлучательному переносу энергии от молеклы флуорофора к молекуле гасителя и рассеиванию энергии.

Схема расщепления зонда в ходе реакции ПЦР:

Шкала синтеза:

Возможен синтез различных количеств зондов. Для решения задач, требующих постановки небольшого количества реакций мы рекомендуем заказывать зонды на минимальной шкале синтеза. В этом случае мы гарантируем получение не менее 0,5 оптических единиц или 250 пкмоль зонда (в расчёте на 20-звенник). Этого количества хватит на постановку нескольких десятков реакций. Для уже охарактеризованного зонда шкала синтеза может быть в переделах от 1 до 100 оптических единиц.

Очистка:

Все синтезируемые зонды проходят высокоэффективную очистку. Чистота зонда является очень критичной для ПЦР-РВ, так как, например, наличие в смеси олигонуклеотидов, содержащих флуоресцентную метку, но не содержащих гаситель флуоресценции, приводит к существенному возрастанию фонового сигнала. Использование комплексной очистки позволяет гарантировать заказчику высокую (более 95%) чистоту зонда.

Очистка флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов осуществляется в два этапа:

• очистка методом электрофореза в полиакриламидном геле;
• очистка методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

ПОМНИТЕ!!! Качественная очистка увеличивает специфичность и чувствительность метода.

Контроль качества:

Контроль качества осуществляется в ходе очистки зонда в полиакриламидном геле и при очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Также контроль качества осуществляется пост-синтетически методами спектрофотометрии и капиллярного гель-электрофореза.

Стоимость зондов:

Предлагаемые нами цены на зонды являются самыми низкими, благодаря использованию собственных синтонов – амидофосфитов и CPG флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции.