Анализ ГМО методом ПЦР в реальном времени


Наборы реагентов «ГМО Детект» производства ООО «Синтол» позволяют обнаружить все зарегистрированные в России линии ГМО растительного происхождения и 94% зарегистрированных в мире ГМО.



Метод ПЦР в реальном времени

В наборах реагентов «ГМО Детект» используется метод ПЦР в реальном времени – наиболее надёжный метод тестирования ГМO, который позволяет провести как качественный, так и количественный анализ. Метод высокочувствительный и высокоточный.

Наборы реагентов «ГМО Детект»

  • чувствительность наборов реагентов — не более 10 копий ДНК или не более 0,01 % ДНК ГМ-растений;
  • высокая специфичность обнаружения ГМО;
  • тест-системы удовлетворяют международным требованиям по параметрам предела обнаружения (LOD) и предела количественного определения (LOQ);
  • наличие реакции внутреннего положительного контроля (ВПК) позволяет исключить ложноотрицательные результаты;
  • высокая (более 90%) эффективность прохождения реакции ПЦР-РВ;
  • наличие готовых шаблонов для обработки и пред-ставления результатов анализа;
  • каждый пользователь получает подробное иллюстрированное руководство по анализу ГМО;

АЛГОРИТМ АНАЛИЗА ГМО растительного происхождения


Обнаружение большинства (94%) зарегистрированных в мире ГМО

Согласно международной базе данных по ГМ‑растениям ISAAA, в настоящее время (04.2018г.) в мире разрешены к использованию 494 ГМ‑линии 29 видов растений.
Промоторы CaMV 35S (из вируса мозаики цветной капусты) и/или FMV 35S (из вируса мозаики норичника) содержатся в 76% всех зарегистрированных в мире ГМ-растений.
Терминатор NOS (из Agrobacterium tumefaciens) присутствует в 66% всех зарегистрированных в мире ГМ‑растений.
Однако, сейчас при создании новых линий ГМО все чаще стали использовать другие регуляторные последовательности. Поэтому обнаружения основных регуляторных последовательностей (CaMV 35S, FMV 35S, NOS) при скрининге ГМО может быть недостаточно для выявления всех разрешённых и неразрешённых в России ГМО.


Зарегистрированные в России линии ГМО ( по состоянию на 04.2018)
Линия ГМО Производитель Гены Промоторы Терминаторы
1 Соя GTS 40-3-2 Monsanto Company, США cp4 epsps CaMV E35S NOS
2 Соя MON 89788 Monsanto Company, США cp4 epsps FMV 35S
TSF1
rbcS-E9

3 Соя A2704-12 Bayer CropScience AG, Германия pat CaMV 35S CaMV 35S
4 Соя A5547-127 Bayer CropScience AG, Германия pat CaMV 35S CaMV 35S
5 Соя BPS-CV127-9 BASF Plant Science GmbH, Германия csr1-2 AHASL UTR AHASL UTR
6 Соя MON 87701 Monsanto Company, США cry1Ac SsuAra 7Sα’
7 Соя SYHTØH2 Bayer CropScience AG, Германия Syngenta AG, Швейцария pat avhppd-03 CaMV 35S
FMV 35S

CMP
NOS
(3 вставки)
8 Соя FG72 Bayer CropScience AG, Германия 2mepsps
hppd W336
H4A748
H4A748 ABBC
H4A7483’UTR
NOS (2 вставки)
9 Соя
MON87701 X MON89788
Monsanto Company, США cry1Ac
cp4 epsps
SsuAra
FMV 35S
7Sα’
rbcS-E9
10 Кукуруза MON 810 Monsanto Company, США cry1Ab CaMV E35S -
11 Кукуруза MON 863 Monsanto Company, США cry3Bb1
nptII
4AS1
CaMV E35S
tahsp 17
NOS
12
Кукуруза NK 603 Monsanto Company, США cp4 epsps

CaMV E35S
ract1
NOS
(2 вставки)
13 Кукуруза MON 88017 Monsanto Company, США cp4 epsps
cry3Bb1
ract1
CaMV 35S
NOS
tahsp 17
14 Кукуруза GA21 Syngenta AG, Швейцария m epsps ract1 NOS
(3 вставки)
15 Кукуруза Bt11 Syngenta AG, Швейцария cry1Ab
pat
CaMV 35S
(2 вставки )
NOS
(2 вставки)
16 Кукуруза MIR 604 Syngenta AG, Швейцария mcry3A
pmi
MTL
ZmUbilnt
NOS
(2 вставки)
17 Кукуруза 3272 Syngenta AG, Швейцария amy797E
pmi

GZein Promoter
ZmUbilnt
CaMV 35S
NOS

18 Кукуруза T2 Bayer CropScience AG, Германия pat CaMV 35S CaMV 35S
19 Кукуруза MIR 162 Syngenta AG, Швейцария vip 3Aa20
pmi
ZmUbilnt

CaMV 35S
NOS
20 Кукуруза 5307 Syngenta AG, Швейцария pmi ecry3.1Ab CMP
ZmUbilnt
NOS
(2 вставки)
21 Кукуруза MON 89034 Monsanto Company, США cry2Ab2 cry1A.105 CaMV E35S
CaMV 35S
FMV 35S
NOS
(2 вставки)
T-Hsp17
22 Кукуруза TC1507 DuPont, США
Dow AgroSciences LLC, США
cry1Fa2
pat
UbiZm1
CaMV 35S
Orf25polyA
CaMV 35S
23 Рис LLRICE 62 Bayer CropScience AG, Германия bar CaMV 35S CaMV 35S
24 Сахарная свекла H7-1 Monsanto Company, США cp4 epsps FMV 35S rbc S2-E9
25 Картофель Луговской 1210 amk Центр "Биоинженерия" РАН, Россия cry3A FMV 35S NOS
26 Картофель Елизавета 2904/1 kgs Центр "Биоинженерия" РАН, Россия cry3A FMV 35S NOS

В качестве дополнительных мишеней для обнаружения ГМ-растений можно рассматривать промотор SsuAra, или rbcS, (из Arabidopsis thaliana) и терминатор Е9 (из гороха), содержащиеся в 18% всех ГМ-линий, а также маркерный ген nptII, содержащийся в 25% всех ГМО. При этом для некоторых видов растений эта задача является наиболее актуальной, так как промотор SsuAra и/или терминатор Е9 содержится в 30-50% ГМ-линий этих растений: 19 линий рапса из 41 содержат промотор SsuAra, 25 линий картофеля из 47 содержат терминатор Е9, 16 линий хлопка из 58 содержат терминатор Е9, 5 линий сои содержат промотор SsuAra и 13 линий сои содержат терминатор Е9.

Какие растения модифицируют методами генной инженерии?
Растение Количество разрешённых в мире ГМ-линий
1 Кукуруза 229
2 Хлопчатник 58
3 Картофель 47
4 Рапс 41
5 Соя 37
6 Гвоздика 19
7 Томат 11
8 Рис 8
9 Люцерна 5
10 Сахарный тростник 4
11 Репа 4
12 Папайя 4
13 Яблоня 3
14 Сахарная свёкла 3
15 Цикорий 3
16 Дыня 2
17 Тыква 2
18 Тополь 2
19 Роза 2
20 Пшеница 1
21 Фасоль 1
22 Баклажан 1
23 Слива 1
24 Перец стручковый сладкий 1
25 Лён 1
26 Петуния 1
27 Полевица 1
28 Табак 1
29 Эвкалипт 1

Обнаружение 26 зарегистрированных в России ГМО

В настоящее время (по состоянию на 04.2018г.) в России зарегистрировано 26 ГМ-линий 5 видов растений (9 линий сои, 13 линий кукурузы, 1 линия риса, 1 линия сахарной свеклы, 2 линии картофеля), которые разрешены для использования в продуктах питания, продовольственном сырье и кормах.
С помощью набора реагентов «Растение/35S+FMV/NOS скрининг» можно обнаружить 24 из 26 зарегистрированных в РФ линий ГМО. Линию сои MON87701, содержащую промотор SsuAra (и не содержащую ни промоторы CaMV 35S и FMV 35S, ни терминатор NOS), можно обнаружить с помощью набора реагентов «Растение/SsuAra/ E9 скрининг».
Линия сои BPS-CV127-9 не содержит промоторы CaMV 35S, FMV 35S, SsuAra, терминаторы NOS, E9, чужеродные гены pat, cp4 epsps, bar, cry3A, nptII, выявляемые наборами реагентов «Растение/35S+FMV/NOS скрининг», «Растение/SsuAra/E9 скрининг», «Pat/EPSPS/Bar скрининг» и «Растение/nptII». Таким образом, обнаружить эту линию можно только с помощью линия-специфичного набора реагентов «Соя BPS-CV127-9 идентификация».

Наборы реагентов «ГМО Детект»


Наборы реагентов «Сорб-ГМО» разработаны специально для выделения ДНК из растительного сырья, пищевых продуктов и кормов. «Сорб-ГМО» имеет 2 модификации: «Сорб-ГМО-А» и «Сорб-ГМО-Б». В обоих наборах для очистки ДНК используется кремниевый сорбент. «Сорб-ГМО-А» в качестве лизирующего агента содержит гуанидин хлорид, а «Сорб-ГМО-Б» — ионный детергент СТАВ, которые обеспечивают максимальный выход ДНК из растительных компонентов.
Набор «Сорб-ГМО-Б» рекомендуется для выделения ДНК из образцов, содержащих много жиров (например, торты, жирная колбаса и др.) Отличительными особенностями «Сорб-ГМО-А» являются быстрота выделения ДНК и отсутствие хлороформа, что делает работу с набором более безопасной.

Наборы реагентов «ГМО-МагноСорб» и «ГМО-МагноСорб-Автомат» позволяют стандартизировать и автоматизировать методику выделения ДНК благодаря использованию в качестве сорбента магнитных частиц.
Эти наборы позволяют быстрее выделить ДНК по сравнению с наборами «Сорб-ГМО-А» и «СорбГМО-Б».

Наборы реагентов серии «ГМО скрининг» позволяют провести качественный анализ образца на присутствие ГМО. По результатам скрининга ГМО исследователь может продумать дальнейший алгоритм анализа, если образец содержит достаточное количество растительной ДНК, (что также определяется с помощью скрининговых наборов).
В наборах этой серии одновременно выявляются:
– растительные гены для подтверждения наличия растительных компонентов в образце и пригодности ДНК для ПЦР-анализа (особенно актуально для высокорафинированных продуктов и продуктов, подвергшихся сильной тепловой или химической обработке, для исключения ложноотрицательных результатов);
– специфичные для ГМО регуляторные последовательности (промоторы CaMV 35S, FMV 35S, SsuAra и терминаторы NOS, E9) или гены (pat, cp4 epsps, bar, cry3A, nptII).
Наборы реагентов этой серии позволяют обнаружить 94% линий ГМ-растений из всех зарегистрированных в мире.

Наборы реагентов серии «ГМО идентификация» позволяют решить наиболее важную и сложную задачу идентификации линий ГМ-растений. Линейка наборов этой серии содержит как наборы для идентификации какой-либо одной конкретной ГМ-линии, так и наборы для идентификации сразу нескольких линий.
Наборы в новом формате «Идентификация-скрин» предназначены для обнаружения и идентификации параллельно 4 или 8 ГМ-линий и сформированы по принципу «1 стрип — 1 образец». Каждый стрип предназначен для анализа 1 образца и содержит 4 или 8 пробирок с раскапанными различными концентрированными реакционными смесями, предназначенными для выявления различных ГМлиний. Наборы такого формата удобны для анализа многокомпонентных образцов, особенно кормов, содержащих несколько ГМ-линий, и позволяют избежать ошибок при выборе исследователем наборов для идентификации ГМ-линий после предварительного этапа скрининга ГМО.
Все наборы серии «ГМО идентификация» являются полуколичественными и позволяют уже на этом этапе определить примерное содержание ГМ-линий в образце в следующих диапазонах:
– более 0,9%;
– менее 0,9%, но более 0,1%;
– менее 0,1%.

Наборы реагентов серии «ГМО количество» предназначены для проведения количественного анализа ГМО: суммарного по промотору CaMV 35S или терминатору NOS и специфического по конкретной линии ГМО.
Рекомендуется количественный анализ конкретных линий ГМО, так как:
– не все линии ГМО содержат промотор CaMV 35S или терминатор NOS, поэтому анализ таких линий по суммарному количеству промотора CaMV 35S или терминатора NOS невозможен;
– разные линии ГМО содержат разное количество вставок CaMV 35S или NOS, что снижает точность анализа по суммарному количеству промотора CaMV 35S или терминатора NOS;
– невозможен анализ смесей различных ГМО по суммарному количеству промотора CaMV 35S или терминатора NOS.

Количественный анализ по конкретной линии ГМО проводится с использованием калибраторов на основе стандартных калибровочных образцов производства Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM, Бельгия), которые представляют собой смеси сои или кукурузы дикого типа (0 % ГМО) и ГМ-сои или кукурузы (100 % ГМО) в определенном процентном соотношении.

Наборы серии «Растение идентификация» предназначены для обнаружения и видовой или родовой идентификации растительной ДНК в процессе анализа ГМО. Серия включает универсальный набор для обнаружения растительной ДНК, наборы для специфического обнаружения ДНК картофеля, риса, томатов, свеклы и мультиплексные наборы для специфического обнаружения сразу нескольких видов растений в 1 пробирке: «Соя/Кукуруза/Рапс» и «Горох/Люцерна/Пшеница». Мультиплексные наборы предназначены для идентификации основных растительных компонентов, наиболее часто встречающихся в комбикормах и сложных пищевых продуктах.


ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ЗАКАЗА
(для приборов с 4-мя и более каналами детекции флуоресценции)*

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК
GM-502 «Сорб-ГМО-А»
GM-503 «Сорб-ГМО-Б»
GM-505 «ГМО-МагноСорб»
GM-506 «ГМО-МагноСорб-Автомат 48»
GM-507 «ГМО-МагноСорб-Автомат 24»
«ГМО СКРИНИНГ»
GM-415 «Растение / 35S + FMV / NOS скрининг»
GM-416 «Соя / 35S + FMV / NOS скрининг»
GM-414 «Кукуруза / 35S / NOS скрининг»
GM-417 «CaMV / 35S скрининг»
GM-430 «Картофель / Cry3A скрининг»
GM-440 «Рапс / Pat / EPSPS / NOS скрининг»
GM-418 «Pat / EPSPS / Bar скрининг»
GM-443 «Растение / SsuAra / E9 скрининг»
GM-444 «Горох / E9 скрининг»
GM-445 «Растение / nptII скрининг»
«ГМО ИДЕНТИФИКАЦИЯ»
GM-260 «Соя идентификация скрин 8»
(идентификация и полуколичественный анализ 8 линий ГМ-сои: GTS 40-3-2, A 2704-12, A5547-127, MON 89788, MON 87701, BPS-CV127-9, SYHT0H2, FG72)
GM-261 «Соя идентификация скрин 4-1»
(идентификация и полуколичественный анализ 4 линий ГМ-сои: GTS 40-3-2, A 2704-12, A5547-127, BPS-CV127-9)
GM-262 «Соя идентификация скрин 4-2»
(идентификация и полуколичественный анализ 4 линий ГМ-сои: MON 89788, MON 87701, SYHT0H2, FG72)
GM-285 «Кукуруза идентификация скрин 8»
(идентификация и полуколичественный анализ 8 линий ГМ-кукурузы: MON 810, NK 60, Bt 11, MON 863, MIR 604, GA 21, T25, 3272)
GM-286 «Кукуруза идентификация скрин 4»
(идентификация и полуколичественный анализ 4 линий ГМ-кукурузы: MON 88017, MIR162, 5307, MON 89034)
GM-201 «Соя GTS 40-3-2 идентификация»
GM-202 «Соя A 2704-12 идентификация»
GM-203 «Соя A 5547-127 идентификация»
GM-204 «Соя MON 89788 идентификация»
GM-205 «Соя BPS-CV127-9 идентификация»
GM-206 «Соя MON 87701 идентификация»
GM-207 «Соя SYHT0H2 идентификация»
GM-208 «Соя FG72 идентификация»
GM-221 «Кукуруза MON 810 идентификация»
GM-222 «Кукуруза NK 603 идентификация»
GM-223 «Кукуруза Bt 11 идентификация»
GM-224 «Кукуруза MON 863 идентификация»
GM-225 «Кукуруза MON 88017 идентификация»
GM-226 «Кукуруза MIR 604 идентификация»
GM-227 «Кукуруза GA 21 идентификация»
GM-228 «Кукуруза T25 идентификация»
GM-229 «Кукуруза 3272 идентификация»
GM-230 «LLRICE 62 идентификация»
GM-231 «Кукуруза MIR 162 идентификация»
GM-232 «Кукуруза 5307 идентификация»
GM-233 «Кукуруза MON 89034 идентификация»
GM-235 «Кукуруза TC 1507 идентификация»
GM-240 «Свекла H7-1 идентификация»
НЕРАЗРЕШЁННЫЕ В РОССИИ ГМ-ЛИНИИ
GM-209 «Соя MON 87705 идентификация»
GM-210 «Соя DP-305423 идентификация»
GM-211 «Соя DP-356043 идентификация»
GM-212 «Соя MON 87769 идентификация»
GM-234 «Кукуруза MON 87460 идентификация»
GM-241 «Рапс GT 73 идентификация»
GM-242 «Рапс T 45 идентификация»
GM-244 «Рапс RF1 идентификация»
GM-245 «Рапс RF3 идентификация»
GM-246 «Рапс MS1 идентификация»
GM-247 «Рапс MON 88302 идентификация»
GM-248 «Рапс RF2 идентификация»
«ГМО КОЛИЧЕСТВО»
GM-329 «Соя / 35S количество»
GM-310 «Соя GTS 40-3-2 количество»
GM-313 «Соя A 2704-12 количество»
GM-314 «Соя A5547-127 количество»
GM-315 «Соя MON 89788 количество»
GM-316 «Соя MON 87701 количество»
GM-317 «Соя BPS-CV127-9 количество»
GM-318 «Соя SYHT0H2 количество»
GM-319 «Соя FG72 количество»
GM-331 «Кукуруза /35S количество»
GM-332 «Кукуруза / NOS количество»
GM-311 «Кукуруза MON 810 количество»
GM-312 «Кукуруза MIR 604 количество»
GM-334 «Кукуруза MIR 162 количество»
GM-335 «Кукуруза 5307 количество»
GM-322 «Кукуруза NK 603 количество»
GM-323 «Кукуруза Bt 11 количество»
GM-324 «Кукуруза MON 863 количество»
GM-325 «Кукуруза MON 863 количество»
GM-326 «Кукуруза GA 21 количество»
GM-327 «Кукуруза T25 количество»
GM-328 «Кукуруза 3272 количество»
GM-330 «Кукуруза MON 89034 количество»
«РАСТЕНИЕ ИДЕНТИФИКАЦИЯ»
GM-101 «Растение универсал»
GM-121 «Соя / Кукуруза / Рапс»
GM-122 «Горох / Люцерна / Пшеница»
GM-104 «Картофель»
GM-105 «Рис»
GM-106 «Томат»
GM-107 «Свекла»

*для 2-канальных приборов каталожные номера уточняйте у менеджеров

Автоматизация выделения ДНК

Компания СИНТОЛ поможет Вам автоматизировать наиболее трудоёмкий этап выделения ДНК с помощью набора для выделения ДНК «Сорб-ГМО-Автомат» и роботизированной станции Freedom EVO (TECAN, Швейцария). Преимущества автоматизации:

  • увеличение производительности лаборатории;
  • уменьшение трудозатрат;
  • стандартизация выделения ДНК;
  • снижение риска контаминации лаборатории.
Роботизированная станция Freedom EVO(ТЕCAN, Швейцария)


Автоматическая обработка результатов анализа

Пример таблицы с интерпретацией результатов, полученных с помощью набора «Кукуруза идентификация скрин 8». Из таблицы видно, что анализируемые образцы содержат кукурузу 3 ГМ-линий: MON810, NK603 и GA21. Набор позволяет получить предварительную количественную оценку анализируемых образцов в диапазонах: более 0,9%; менее 0,9%, но более 0,1%; менее 0,1%. В соответствующих столбцах таблицы указано, что , например, два образца содержат кукурузу линии MON810 в количестве, большем 0,9%, а третий образец содержит кукурузу линии MON810 в количестве менее 0,9%, но более 0,1%.

Кукуруза идентификация скрин 8

Программное обеспечение амплификаторов «АНК-32» и «АНК-48» позволяет автоматически формировать таблицы и отчеты с интерпретацией полученных результатов.

Пример таблицы с интерпретацией результатов, полученных с помощью набора «Растение/ 35S+FMV/ NOS скрининг». Интерпретация полученных результатов показана во втором столбце справа (указано, есть ли растительная ДНК в анализируемых образцах, содержат ли образцы ГМ-растение, достаточно ли ДНК для анализа). Последний столбец содержит рекомендации по дальнейшим действиям оператора.

Пример таблицы с интерпретацией результатов, полученных с помощью набора «Растение/35S + FMV/NOS скрининг». Эта таблица формируется автоматически компьютерной программой к амплификаторам «АНК-32»/«АНК-48». Автоматический анализ полученных результатов показан во втором столбце справа (указано, есть ли растительная ДНК в анализируемых образцах, содержат ли образцы ГМ-растение, достаточно ли ДНК для анализа).Последний столбец содержит рекомендации по дальнейшим действиям оператора
Пример отчётного файла, который автоматически формируется компьютерной программой к приборам «АНК-32»/«АНК-48».


Что делать, если...

Вы обнаружили в ходе анализа промотор CaMV 35S или терминатор E9, но не выявили другие трансгенные последовательности и не идентифицировали какие-либо разрешенные или неразрешенные линии. Необходимо исключить присутствие в образце природных источников найденных регуляторных последовательностей.
Например, промотор CaMV 35S, присутствующий более чем в 70% ГМ-растений, выделен из ДНК вируса мозаики цветной капусты (Cauliflower mosaic virus, CaMV), способного поражать ткани растений семейства Капустные (или Крестоцветные) – Brassicaceae (белокочанная капуста, цветная капуста, брокколи, китайская капуста, брюссельская капуста, репа, турнепс, хрен, горчица, редис, редька, рапс, кресс-салат, брюква). Для подтверждения природного происхождения промотора CaMV 35S и исключения присутствия ГМО в образце необходимо использовать набор реагентов «CaMV /35S скрининг».

CamV/35S скрининг

Аналогично, терминатор Е9 был выделен из генома гороха (Pisum sativum), а промотор SsuAra – из резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana).
Так как горох довольно часто используется в пищевой продукции и кормах, необходимо обязательно при обнаружении терминатора Е9 и отсутствии каких-либо других трансгенных последовательностей анализировать образец на наличие ДНК гороха.
Таким образом, наборы реагентов «CaMV/35S скрининг» и «Горох/Е9 скрининг» позволяют обнаружить ДНК вируса мозаики цветной капусты и ДНК гороха соответственно и определить происхождение (природное или трансгенное) промотора CaMV 35S и терминатора E9.

Горох/Е9 скрининг

Вы обнаружили в ходе анализа одну или несколько регуляторных последовательностей, но при идентификации линии ГМО не обнаружили ни одну из зарегистрированных в России линий ГМО. Можно использовать набор реагентов «Pat/EPSPS/Bar скрининг», позволяющий обнаружить чужеродные гены pat, cp4 epsps, bar, которые наиболее часто встречаются в ГМ-растениях, и подтвердить факт выявления незарегистрированной в России линии ГМО (без идентификации конкретной линии).

Pat/ EPSPS/ Bar скрининг


Вернуться в раздел