Для диагностики туберкулёза


Наборы реагентов «Амплитуб» для быстрой диагностики туберкулёза, в том числе с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ, ШЛУ-ТБ).
tuberkulez.jpg
В  2004  году  по  инициативе  д.м.н., профессора Михаила Александровича Владимирского, заведующего сектором молекулярной диагностики туберкулёза НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова, мы  начали разработки  в  области  ПЦР-диагностики туберкулёза.
«Амплитуб» - технология  быстрой  молекулярно-генетической диагностики туберкулёза для выявления микобактерий туберкулёзного комплекса, определения инфекционной опасности больного, определения антибиотикоустойчивости  к  препаратам I  и II ряда, идентификации и генотипирования микобактерий.


Технология «Амплитуб» состоит из 3-х основных этапов: пробоподготовки, выделения ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Оригинальные  технологические разработки нашей компании  применяются  на каждом  из  этих  этапов  и  в совокупности обеспечивают высочайшую чувствительность, специфичность  и информативность  анализа, быстроту получения результатов и их высокую достоверность.

I этап
Пробоподготовка:  в  процессе  инкубации  с  «Инактивирующим реагентом А» происходит инактивация микобактерий,  разжижение  и  гомогенизация  респираторных образцов.

II этап
Выделение ДНК: использование оригинальных реагентов  и  магнитных  частиц  обеспечивает  получение максимального  количества  чистой ДНК   и   позволяет автоматизировать процесс выделения ДНК.

III этап
ПЦР в реальном  времени: 
одновременная  детекция нескольких различных участков генома комплекса микобактерий туберкулёза (МБТ) увеличивает  информативность и достоверность анализа.


Преимущества технологии «АМПЛИТУБ»


Скорость
Технология   «Амплитуб»   позволяет   сократить   время, необходимое  для  обнаружения M.tuberculosis  complex  и определения лекарственной устойчивости с 1-3 месяцев до 1 дня в сравнении с традиционными культуральными  методами.

Высокая достоверность результатов

Высокая достоверность результатов обеспечивается как на этапе обнаружения МБТ, так и на этапе определения антибиотикоустойчивости. Применение технологии «Амплитуб»   позволяет   обнаружить   МБТ   с   высокой чувствительностью  (не  более  100  КОЕ/мл  мокроты)  и 100%   специфичностью.  Точное   определение   мутаций  в    наиболее    значимых    кодонах    основных    генов, ассоциирующихся  с    лекарственной  устойчивостью  к рифампицину и  изониазиду, позволяет определить  90% антибиотикоустойчивых  образцов  со  специфичностью,  близкой к 100%.                             

Безопасность
Клинические    образцы    инактивируются    с    помощью «Инактивирующего  реагента  А»  уже  на  этапе  взятия  и транспортировки биологического материала.

Возможность работы с клиническими образцами

Важным  преимуществом  технологии  «Амплитуб»  является   возможность   исследования   не   только   культур микобактерий,   но   и   непосредственно   клинического материала (мокроты, промывных вод бронхов, спинномозговой жидкости, экссудата, пунктата, биоптата, мочи, отделяемого половых путей).

Автоматизация
Роботизированная  станция  TECAN  и  набор  реагентов «М-Сорб-Туб-Автомат»  позволяют  полностью  автоматизировать  наиболее  трудоёмкий  этап  выделения  ДНК.  Технология  «Амплитуб»  обеспечивает  автоматический расчет результатов ПЦР-анализа с указанием количества выявленного   возбудителя   в   образце   и конкретных мутаций, определяющих устойчивость к антибиотикам.


I этап - Пробоподготовка инактивация

t4.png
«Инактивирующий реагент А»
специально   адаптирован   для   обработки   мокроты.
Обладает исключительными муколизирующими свойствами, благодаря которым может использоваться вместо  раствора  NALC-NaOH  для  обработки  мокроты  перед молекулярно-генетическими исследованиями.
 
tub-shema.jpg
tabl_tub.jpg

tub-foto.jpg
Клинические  и  технические  испытания  «Инактивирующего реагента А» проводились   в ЦНИИ туберкулёза  (Москва). 118  образцов  мокроты  от тяжёлых бациллярных  больных с острым течением туберкулёза  делили  на  две  части,  обрабатывали одну часть «Инактивирующим реагентом А», другую — NALC-NaOH.

Все образцы тестировали на BACTEC MGIT 960 и методом  ПЦР  в  реальном времени  (ПЦР-РВ).  Рост микобактерий  наблюдался  только  в  контрольной группе,  обработанной  NALC-NaOH. В  образцах,  обработанных   «Инактивирующим реагентом А», рост    микобактерий    не    обнаружен.    Результаты ПЦР-анализа    образцов    из    обеих    групп    были положительными.
t7.png


II этап - Выделение ДНК

Компанией «Синтол» разработан ряд наборов реагентов для выделения ДНК микобактерий.
«М-Сорб-Туб» —  набор  реагентов  для  выделения ДНК микобактерий из клинических образцов и культур клеток (на магнитных частицах).
  • Адаптирован   для   выделения   ДНК   микобактерий из   мокроты,   промывных   вод   бронхов,   спинномозговой жидкости,  экссудата,  пунктата,  биоптата,  мочи, отделяемого половых путей, культур клеток.
  • Набор   «М-Сорб-Туб»   обеспечивает   лизис   клеток, сорбцию  ДНК  на  магнитных  частицах,  осаждение  ДНК центрифугированием, промывку и элюцию ДНК.
  • Предлагаемая компанией «Синтол» методика  выделения  ДНК  сочетает  в  себе  достоинства  сорбционного метода и метода осаждения спиртом.
  • Использование в качестве сорбента покрытых оксидом кремния магнитных частиц  более удобно в сравнении  с использованием  других  сорбентов,  позволяет максимально  стандартизировать  и  автоматизировать методику выделения ДНК.
  •  В    каждый    исследуемый    образец    добавляется внутренний  положительный  контроль  (ВПК),  по  реакции амплификации  ВПК  судят  о  наличии/отсутствии ингибиторов ПЦР и эффективности выделения ДНК.
«М-Сорб-Туб-Автомат»  —  набор реагентов для выделения ДНК микобактерий из клинических образцов и культур клеток на автоматизированных станциях TECAN.

t8.png
Набор    представляет    собой    модификацию    набора реагентов  «М-Сорб-Туб»,  разработанную специально для  использования  на  автоматизированных  станциях фирмы   TECAN,   что   обеспечивает ряд   следующих преимуществ.


  • Снижение риска контаминации во время выделения ДНК практически до нуля.
  • Значительное  уменьшение  трудоёмкости  процесса выделения ДНК.
  • Стандартизированное выделение ДНК из клинических  образцов.
  • Экономическая  выгода:  низкий  расход  пластика  и реактивов.
«Экстра-Туб»    —  набор  реагентов  для  ускоренной пробоподготовки  и  выделения  ДНК  микобактерий из образцов мокроты.
  • Совмещение процесса пробоподготовки и выделения ДНК из образцов мокроты позволяет провести эти два этапа работы за 1 час.
  • Минимальное  количество  манипуляций  при  пробоподготовке  и  выделении  ДНК.  Набор  состоит  из  3 рабочих  растворов:  «Инактивирующего  реагента  А», лизирующего и элюирующего растворов.
  • Использование  «Инактивирующего  реагента  А»  в составе   набора   «Экстра-Туб»   позволяет   увеличить выход ДНК в 5-10 раз.


III этап - ПЦР в реальном времени

Обнаружение и количественное определение комплекса МБТ
Набор реагентов АМПЛИТУБ-РВ – это:
  • высокая  достоверность  анализа  благодаря  одновременному     обнаружению     двух     специфичных генов M.tuberculosis complex: IS6110 и regX3;
  • оценка  пригодности  образца  ДНК  для  определения антибиотикоустойчивости;
  • высокая чувствительность (не более 100 КОЕ/мл мокроты или 1-10 копий фрагментов ДНК в реакции) и 100%-ая   специфичность,   подтверждённые   на   панели QCMD  (Quality  Control  for  Molecular  Diagnostics)  Mtb  EQA (UK).
Определение антибиотикоустойчивости МБТ к препаратам I и II ряда
Наборы  реагентов  АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ,  АМПЛИТУБ- ШЛУ-РВ – это:
  • диагностика    форм    туберкулеза    с    лекарственной устойчивостью, в том числе множественной лекарственной  устойчивостью  (МЛУ)  и  широкой  лекарственной  устойчивостью (ШЛУ);
  • быстрая   детекция   мутаций  M.tuberculosis,   ассоциирующихся  с  устойчивостью  к  антибиотикам  первого и  второго  ряда  (рифампицину,  изониазиду,  этамбутолу, фторхинолонам);
  • достоверность результатов, ежегодно подтверждаемая  при  проведении  Федеральной  службой  внешней оценки качества (ФСВОК) Росздравнадзора испытаний шифрованных тест-культур и образцов.
Дифференциация внутри M. tuberculosis complex
АМПЛИТУБ-ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ  —  набор  реагентов для  дифференциации  видов  микобактерий, входящих в M.  tuberculosis  complex  (M.  tuberculosis,  M.  bovis,  M. bovis BCG и др. видов).

Генотипирование микобактерий
АМПЛИТУБ-Beijing  —  набор реагентов для определения генотипа Beijing микобактерий туберкулёза.

t9.png

Наборы АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ и АМПЛИТУБ-ШЛУ- РВ  основаны на использовании оригинальной мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени, позволяющей   выявлять мутации в генах микобактерий туберкулеза, ответственных за устойчивость к конкретным антибиотикам.

Принцип  мультиконкурентной  аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени.
  • tub-shema3.jpgВ  формате  одной  пробирки  используются  5’-флуоресцентно-меченые      аллель-специфичные      праймеры   с   общим   комплементарным   им   3’-меченым олигонуклеотидом-гасителем  и  контрольный  флуоресцентный   зонд,   комплементарный   участку   ДНК   без мутаций.
  • При  отсутствии    мутаций  в  ДНК  нарастание  флуоресценции   в   ходе   ПЦР-РВ   наблюдается   только   по флуорофору зонда.
  • При  наличии    мутаций  в  ДНК  нарастание  флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается как по флуорофору зонда, так и по флуорофору 5’-флуоресцентно-меченого аллель-специфичного праймера. Данный метод позволяет  определить  не  только  точку  мутации,  но  и процент  устойчивого  мутантного  штамма  МБТ  на  фоне дикого.

Использование автоматизированных станций Freedom EVO (TECAN, Швейцария) для молекулярно-генетической диагностики туберкулёза

В 2011 году по инициативе сотрудников лаборатории молекулярно-генетических методов исследования    ЦНИИТ    РАМН    группа разработчиков из ЦНИИТ под руководством профессора Черноусовой  Ларисы Николаевны и «Синтола» впервые в России внедрила в лабораторную  практику высокопроизводительную     автоматизи-рованную   систему   выделения ДНК микобактерий на платформе Freedom  EVO  (TECAN)  с использованием     наборов     реагентов  «Амплитуб».    Это    позволило значительно  сократить трудоёмкость  ПЦР-диагностики  туберкулёза и увеличить поток анализов.

tub-shema2.jpg

Время анализа МБТ при использовании автоматизированных станций Freedom EVO («TECAN», Швейцария) и наборов реагентов «Амплитуб» («СИНТОЛ», Россия)

t13.png
Трудозатраты - 1 час
Продолжительность выделения ДНК –  не более 2 часов
Подготовка к амплификации и ПЦР-РВ –  1,5 часа

ИТОГО: результаты анализа будут готовы через 3,5 часа
Оператор затратит 1 час своего рабочего времени.


Устройство автоматизированной станции Freedom EVO («TECAN», Швейцария) показано ниже:

t14.png

Выбирая технологию «Амплитуб» («Синтол») на платформе Freedom EVO («TECAN»),
Вы получаете:
  • Обнаружение возбудителя туберкулёза –  48 образцов за 3 часа
  • Определение лекарственной устойчивости к препаратам I и II ряда за 1 день
  • Уменьшение трудозатрат в 6 раз
  • Увеличение производительности лаборатории
  • Безопасность работы благодаря «Инактивирующему реагенту А»
  • Стандартизованное выделение ДНК
  • Снижение риска контаминации лаборатории
  • Низкую себестоимость 1 анализа
  • Признательность фтизиатров за быструю и точную диагностику!
Документы
Загрузить брошюру "Молекулярно-генетическая диагностика туберкулёза методом ПЦР в реальном времени"
Загрузить брошюру "Быстро обнаружить - успешно вылечить!"

Вернуться в раздел