Нужна ли очистка олигонуклеотидов

Синтез олигонуклеотидов осуществляется на автоматическом синтезаторе амидофосфитным методом. Суть метода заключается в последовательном наращивании олигонуклеотидной цепи соответствующим активированным мономером. Уровень чистоты целевого олигонуклеотида определяется эффективностью присоединения мономера к полинуклеотидной цепи на каждой стадии синтеза.
Амидофосфитный метод позволяет проводить конденсацию на каждой стадии в среднем на 98.5%. Таким образом, для N-звенного олигонуклеотида необходимо провести N циклов присоединения нуклеотида к растущей олигонуклеотидной цепи, а значит, конечный выход продукта будет равен:

ПОМНИТЕ! Чем длиннее Ваш олигонуклеотид, тем более необходима его очистка.
Какой уровень чистоты олигонуклеотида необходим для вашей работы?

Основная цель очистки заключается в удалении образующихся в процессе синтеза укороченных последовательностей и выделении олигонуклеотида целевой длины. "Синтол" для очистки олигонуклеотидов использует гель-электрофорез или ВЭЖХ.
Условия очистки подобраны в соответствии с длиной, последовательностью и природой олигонуклеотида для обеспечения максимального разделения продуктов синтеза. Мы можем гарантировать 90-98% чистоты для всех олигонуклеотидов, которые Вы заказываете у нас.
Таким образом, для того, чтобы выбрать между неочищенным или очищенным олигонуклеотидом, необходимо знать, как повлияет примесь укороченных последовательностей на прецизионность эксперимента.
Здесь приведены некоторые данные, связанные с выбором уровня чистоты олигонуклеотида, допустимого для разного рода экспериментов.

ПОМНИТЕ! Успех Вашего эксперимента в значительной степени определяется чистотой используемых олигонуклеотидов.
Очистка олигонуклеотидов с помощью гель-электрофореза

Разделение олигонуклеотидов под действием электрического тока происходит в зависимости от молекулярного веса и длины образца. При этом олигонуклеотиды, содержащие так называемые мигающие нуклеотиды, в процессе гель-электрофореза не разделяются.
Препаративная электрофоретическая очистка олигонуклеотидов производится в 10-20% полиакриламидном геле в зависимости от длины олигонуклеотида, т.е. в условиях максимального разделения продуктов синтеза. Разделение ведется в денатурирующих условиях (7 М мочевина) для того, чтобы предотвратить образование олигонуклеотидом вторичных структур. Разделение в присутствие маркеров длин позволяет точно идентифицировать олигонуклеотиды целевой длины.
Визуализация геля производится на ТСХ пластине под УФ-лампой. Этот метод детекции позволяет различить олигонуклеотиды, количества которых превышают 0.1 ое.
Олигонуклеотид целевой длины вырезается из геля, выделяется и обессоливается. Измерение концентрации олигонуклеотида производится с использованием двулучевого УФ-спектрофотометра при длине волны 260 нм в области максимального поглощения олигонуклеотида.
Электрофоретическая очистка олигонуклеотидов позволяет достигнуть 95-99% чистоты для коротких олигонуклеотидов (<25 звеньев) и 85-90% - для длинных (>30 звеньев).
ПОМНИТЕ!
- Очистка в ПААГ может быть использована только для небольших количеств олигонуклеотидов (до 10 ое).
- Олигонуклеотиды, содержащие большое количество гуанина, склонны к образованию высоко стабильных вторичных структур, не разрушающихся даже в 7М мочевине, и поэтому эффективность очистки для таких G-богатых олигонуклеотидов значительно снижается.
Очистка олигонуклеотидов с помощью ВЭЖХ

Принцип метода основан на разделении молекул различной гидрофобности, содержащих и не содержащих диметокситритильную группу. Хроматографическая колонка с гидрофобным носителем адсорбирует оба типа молекул. Однако более гидрофобные молекулы удерживаются на колонке дольше, чем менее гидрофобные при элюции градиентом буфера.
После выделения целевого олигонуклеотида диметокситритильная группа удаляется, а олигонуклеотид обессоливается. Чистота хроматографически очищенного олигонуклеотида подтверждается далее с помощью аналитического гель-электрофореза.
Обращенно-фазовая ВЭЖХ позволяет получить большие количества очищенных олигонуклеотидов. При этом возможная степень очистки составляет 90-95%. Вместе с тем, при очистке олигонуклеотидов, длина которых превышает 50 звеньев, эффективность разделения продуктов синтеза может значительно снижаться.
ПОМНИТЕ! G-богатыми олигонуклеотиды, склонные к образованию высокостабильных вторичных структур, не могут быть выделены с помощью этого метода.
Вернуться в раздел