Флуоресцентно-меченные олигонуклеотиды


Сотрудниками компании СИНТОЛ разработана технология синтеза и очистки флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов, а также олигонуклеотидов, содержащих два красителя.

of-4.jpg


Флуоресцентные красители могут быть введены на 5'- и/или 3'-конец, а также внутрь олигонуклеотидной цепи.
Красители могут быть введены в олигонуклеотид различными путями:

  • в виде амидофосфита красителя по протоколу стандартного твердофазного синтеза (в любое положение олигонуклеотида);
  • используя краситель, присоединенный к подложке CPG (control pore glass) (только на 3'-конец);
  • проводя пост-синтетическую конденсацию активированного производного красителя с аминолинкером, присоединенным на олигонуклеотид (в любое положение олигонуклеотида).

Как правило, первые два пути характеризуются высокими выходами. Третий путь требует проведения двух очисток, поэтому для него характерны более низкие выходы. Однако именно третий путь синтеза позволяет получать флуоресцентно-меченные олигонуклеотиды, обладающие наименьшей фоновой флуоресценцией, что обеспечивает наибольшую чувствительность метода.

Сокращенное обозначение

Полное название

Положение в олигонуклеотиде

5'

3'

In*

Acridine

2-(N-акридинил-4-аминобутил)-1,3-пропандиол

-

+

-

Pyrene

1-пирен-бутановая кислота

+

+

+

Dansyl

6-(5-диметилфминонафталин-1-сульфонил)аминопропанол

+

-

-

FAM

5(6)-карбоксифлуоресцеин

+

+

+

R110

5(6)-карбоксиродамин 110

+

+

+

JOE

6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин

+

+

+

R6G

5(6)-карбоксиродамин R6G

+

+

+

TAMRA

5(6)-карбокситетраметилродамин

+

+

+

ROX

5(6)-карбокси-Х-родамин

+

+

+

Dabsyl

4-((4-(диметиламино)-фенил)азо)-бензолсульфоновая кислота

+

+

+


Введение красителя внутрь олигонуклеотида требует использования дополнительной модификации, а именно аминолинкера dT-C6. Таким образом, стоимость такого введения в 1,5 раза выше, чем стоимость введения красителя на 5' или 3' концы.


fmo-1.png
Флуоресцентно-меченные олигонуклеотиды для секвенирования

Очистка:

Нами используется постсинтетическая схема введения флуоресцентных красителей в состав олигонуклеотида (за исключением Dansyl, 3'-TAMRA, 3'-FAM и 3'-DABSYL меченных олигонуклеотидов). Для обеспечения введения флуоресцентного красителя олигонуклеотид содержит аминолинкер. После проведения реакции конденсации активированного производного красителя и первичной аминогруппы линкера, олигонуклеотид очищается от избытка непрореагировавшего красителя, солей и непрореагировавшего олигонуклеотида.

Очистка флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов осуществляется в два этапа:

fmo-2.png
  • очистка методом гель-фильтрации (удаление непрореагировавшего красителя и солей);
  • очистка методом обращенно-фазовой ВЭЖХ или методом электрофореза в полиакриламидном геле (удаление непрореагировавшего олигонуклеотида).

Гарантированный минимальный выход модифицированного олигонуклеотида на шкале синтеза 40 нмоль — 1 ОЕ (5 нмоль) и на шкале 0,5 мкмоль — 3 ОЕ (15 нмоль). Гарантированная чистота олигонуклеотида — не менее 95%.

Контроль качества:

Качество флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов контролируется:

  • Визуально при очистке в ПААГ/ВЭЖХ;
  • Спектрофотометрически;
  • Методом Капиллярного Электрофореза (для флуоресцеин-меченных олигонуклеотидов).
fmo-3.png
Спектр поглощения олигонуклеотида,
меченного двумя флуоресцентными красками
fmo-4.png
Картинка анализа
флуоресцеин-меченного олигонуклеотида
методом капиллярного электрофореза*

Данные получены на приборе КЭФ "НАНОФОР-02", разработанном в Институте Аналитического Приборостроения РАН, г.Санкт-Петербург

Гарантии:

Мы гарантируем правильную последовательность, наличие и функциональность модификации, чистоту не менее 95% и соответствие заказанного и выданного количества олигонуклеотида.

ПОМНИТЕ! Качественная очистка олигонуклеотида увеличивает чувствительность метода.



Вернуться в раздел