Зонды для ПЦР в реальном времени

Метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) стал в настоящее время признанным стандартом при исследовании ДНК и РНК. Он позволяет определять кинетику реакции и на основе полученной информации судить о наличии и исходном количестве ДНК-мишени в образце. Кроме того, метод ПЦР-РВ позволяет определять известные мутации в последовательности ДНК и их процентное содержание. Важным достоинством метода является отсутствие необходимости в постреакционных манипуляциях с образцами и, как следствие, снижение риска контаминации, сокращение времени анализа и упрощение организации ПЦР-лаборатории.

of-5


Зонд для ПЦР в реальном времени
является важным компонентом реакционной смеси. Он представляет собой олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. Последовательность зонда подбирается таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами.

Флуоресцентные красители (флуорофоры) - это молекулы, которые при поглощении фотона испускают свет с большей длиной волны (т.е. флуоресцируют). Существует большое число флуорофоров, отличающихся по спектру флуоресценции.

Гаситель флуоресценции - молекула, спектр поглощения которой лежит в области длин волн спектра испускания флуорофора. Тушение флуоресценции происходит благодаря безызлучательному переносу энергии от молекулы флуорофора к молекуле гасителя и рассеиванию энергии.

Схема расщепления зонда в ходе реакции ПЦР:

shema-ras-zonda-pcr.jpgВозможно следующее взаимное расположение красителей
(на примере пары FAM - BHQ1):

FAM-BHQ1.jpg

Компания СИНТОЛ предлагает широкий выбор флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции:

Флуоресцентный краситель
λмакс. поглощения, нм
λмакс. флуоресценции, нм
FAM490520
R6G520550
TAMRA550580
ROX580610
Cy5645670
Cy5.5new680705

Гаситель флуоресценции
λмакс. поглощения, нмДиапазон гашения, нм
RTQ-1new520470-570
BHQ-1535480-580
BHQ-2575550-650
BHQ-3670620-730



Флуорофоры и гасители флуоресценции.

Как правило, корректное проведение ПЦР-эксперимента требует постановки нескольких реакций в одной пробирке одновременно. Для этого необходимо использовать зонды, меченные разными флуоресцентными красителями и соответствующими им гасителями флуоресценции.

Для эффективного гашения флуоресценции спектр поглощения гасителя должен перекрывать спектр флуоресценции флуорофора. Возможен широкий выбор комбинаций флуорофоров и эффективных гасителей флуоресценции.


fam.jpg r6g.jpg rox.jpg cy5.jpg cy5-5.jpg cy7.jpg

spektry.jpg
Спектры поглощения гасителей флуоресценции Dabsyl, BHQ1, BHQ2, BHQ3 и новых гасителей производства СИНТОЛ: RTQ1, RTQ2 (Real Time Quencher). Гасители серии RTQ обеспечивают в 1,5-2 раза более эффективное гашение флуоресценции FAM и ROX, а также эффективное гашение Cy5.

tabl-krasitelei.jpg
Таблица рекомендуемых для линейных зондов комбинаций красителей


Шкала синтеза:

Возможен синтез различного количества зондов. Для решения задач, требующих постановки небольшого количества реакций, мы рекомендуем заказывать зонды на минимальной шкале синтеза. В этом случае мы гарантируем получение не менее 0,5 оптических единиц или 250 пкмоль зонда (в расчёте на 20-звенник). Этого количества хватит на постановку нескольких десятков реакций. Для уже охарактеризованного зонда шкала синтеза может быть в пределах от 1 до 100 оптических единиц.

Очистка:

Все синтезируемые зонды проходят высокоэффективную очистку. Чистота зонда является очень критичной для ПЦР-РВ, так как, например, наличие в смеси олигонуклеотидов, содержащих флуоресцентную метку, но не содержащих гаситель флуоресценции, приводит к существенному возрастанию фонового сигнала. Использование комплексной очистки позволяет гарантировать заказчику высокую (более 95%) чистоту зонда.

Очистка флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов осуществляется в два этапа:
ПОМНИТЕ!!! Качественная очистка увеличивает специфичность и чувствительность метода.

Контроль качества:
Контроль качества осуществляется в ходе очистки зонда в полиакриламидном геле и при очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Также контроль качества осуществляется постсинтетически методами спектрофотометрии и капиллярного гель-электрофореза.

Стоимость зондов:
Предлагаемые нами цены на зонды являются самыми низкими благодаря использованию собственных синтонов – амидофосфитов и CPG флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции.


Компания СИНТОЛ предлагает широкий выбор зондов для ПЦР в реальном времени. Вы можете заказать у нас зонды для работы на любых приборах для ПЦР в реальном времени, с любыми молекулярными вариантами реализации метода (TaqMan Probes, Molecular Beacons, Hybridization Probes, Scorpions Probes и т.д.)



Вернуться в раздел