Зонды для ПЦР в реальном времени
Метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) стал в настоящее время признанным стандартом при исследовании ДНК и РНК. Он позволяет определять кинетику реакции и на основе полученной информации судить о наличии и исходном количестве ДНК-мишени в образце. Кроме того, метод ПЦР-РВ позволяет определять известные мутации в последовательности ДНК и их процентное содержание. Важным достоинством метода является отсутствие необходимости в постреакционных манипуляциях с образцами и, как следствие, снижение риска контаминации, сокращение времени анализа и упрощение организации ПЦР-лаборатории.
Зонд для ПЦР в реальном времени является важным компонентом реакционной смеси. Он представляет собой олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. Последовательность зонда подбирается таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами.
Флуоресцентные красители (флуорофоры) - это молекулы, которые при поглощении фотона испускают свет с большей длиной волны (т.е. флуоресцируют). Существует большое число флуорофоров, отличающихся по спектру флуоресценции.
Гаситель флуоресценции - молекула, спектр поглощения которой лежит в области длин волн спектра испускания флуорофора. Тушение флуоресценции происходит благодаря безызлучательному переносу энергии от молекулы флуорофора к молекуле гасителя и рассеиванию энергии.
Флуорофоры и гасители флуоресценции.
Как правило, корректное проведение ПЦР-эксперимента требует постановки нескольких реакций в одной пробирке одновременно. Для этого необходимо использовать зонды, меченные разными флуоресцентными красителями и соответствующими им гасителями флуоресценции.
Для эффективного гашения флуоресценции спектр поглощения гасителя должен перекрывать спектр флуоресценции флуорофора. Возможен широкий выбор комбинаций флуорофоров и эффективных гасителей флуоресценции.
Шкала синтеза:
Возможен синтез различного количества зондов. Для решения задач, требующих постановки небольшого количества реакций, мы рекомендуем заказывать зонды на минимальной шкале синтеза. В этом случае мы гарантируем получение не менее 0,5 оптических единиц или 250 пкмоль зонда (в расчёте на 20-звенник). Этого количества хватит на постановку нескольких десятков реакций. Для уже охарактеризованного зонда шкала синтеза может быть в пределах от 1 до 100 оптических единиц.
Очистка:
Все синтезируемые зонды проходят высокоэффективную очистку. Чистота зонда является очень критичной для ПЦР-РВ, так как, например, наличие в смеси олигонуклеотидов, содержащих флуоресцентную метку, но не содержащих гаситель флуоресценции, приводит к существенному возрастанию фонового сигнала. Использование комплексной очистки позволяет гарантировать заказчику высокую (более 95%) чистоту зонда.
Очистка флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов осуществляется в два этапа:
Контроль качества:
Контроль качества осуществляется в ходе очистки зонда в полиакриламидном геле и при очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Также контроль качества осуществляется постсинтетически методами спектрофотометрии и капиллярного гель-электрофореза.
Стоимость зондов:
Предлагаемые нами цены на зонды являются самыми низкими благодаря использованию собственных синтонов – амидофосфитов и CPG флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции.
Компания СИНТОЛ предлагает широкий выбор зондов для ПЦР в реальном времени. Вы можете заказать у нас зонды для работы на любых приборах для ПЦР в реальном времени, с любыми молекулярными вариантами реализации метода (TaqMan Probes, Molecular Beacons, Hybridization Probes, Scorpions Probes и т.д.)
Зонд для ПЦР в реальном времени является важным компонентом реакционной смеси. Он представляет собой олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора и молекула гасителя флуоресценции. Последовательность зонда подбирается таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами.
Флуоресцентные красители (флуорофоры) - это молекулы, которые при поглощении фотона испускают свет с большей длиной волны (т.е. флуоресцируют). Существует большое число флуорофоров, отличающихся по спектру флуоресценции.
Гаситель флуоресценции - молекула, спектр поглощения которой лежит в области длин волн спектра испускания флуорофора. Тушение флуоресценции происходит благодаря безызлучательному переносу энергии от молекулы флуорофора к молекуле гасителя и рассеиванию энергии.
Схема расщепления зонда в ходе реакции ПЦР:
Компания СИНТОЛ предлагает широкий выбор флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции:
Флуоресцентный краситель
| λмакс. поглощения, нм
| λмакс. флуоресценции, нм
|
FAM | 490 | 520 |
R6G | 520 | 550 |
TAMRA | 550 | 580 |
ROX | 580 | 610 |
Cy5 | 645 | 670 |
Cy5.5new | 680 | 705 |
Гаситель флуоресценции
| λмакс. поглощения, нм | Диапазон гашения, нм |
RTQ-1new | 520 | 470-570 |
BHQ-1 | 535 | 480-580 |
BHQ-2 | 575 | 550-650 |
BHQ-3 | 670 | 620-730 |
Как правило, корректное проведение ПЦР-эксперимента требует постановки нескольких реакций в одной пробирке одновременно. Для этого необходимо использовать зонды, меченные разными флуоресцентными красителями и соответствующими им гасителями флуоресценции.
Для эффективного гашения флуоресценции спектр поглощения гасителя должен перекрывать спектр флуоресценции флуорофора. Возможен широкий выбор комбинаций флуорофоров и эффективных гасителей флуоресценции.
Спектры поглощения гасителей флуоресценции Dabsyl, BHQ1, BHQ2, BHQ3 и новых гасителей производства СИНТОЛ: RTQ1, RTQ2 (Real Time Quencher). Гасители серии RTQ обеспечивают в 1,5-2 раза более эффективное гашение флуоресценции FAM и ROX, а также эффективное гашение Cy5.
Таблица рекомендуемых для линейных зондов комбинаций красителей
Шкала синтеза:
Возможен синтез различного количества зондов. Для решения задач, требующих постановки небольшого количества реакций, мы рекомендуем заказывать зонды на минимальной шкале синтеза. В этом случае мы гарантируем получение не менее 0,5 оптических единиц или 250 пкмоль зонда (в расчёте на 20-звенник). Этого количества хватит на постановку нескольких десятков реакций. Для уже охарактеризованного зонда шкала синтеза может быть в пределах от 1 до 100 оптических единиц.
Очистка:
Все синтезируемые зонды проходят высокоэффективную очистку. Чистота зонда является очень критичной для ПЦР-РВ, так как, например, наличие в смеси олигонуклеотидов, содержащих флуоресцентную метку, но не содержащих гаситель флуоресценции, приводит к существенному возрастанию фонового сигнала. Использование комплексной очистки позволяет гарантировать заказчику высокую (более 95%) чистоту зонда.
Очистка флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов осуществляется в два этапа:
- очистка методом электрофореза в полиакриламидном геле;
- очистка методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Контроль качества:
Контроль качества осуществляется в ходе очистки зонда в полиакриламидном геле и при очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Также контроль качества осуществляется постсинтетически методами спектрофотометрии и капиллярного гель-электрофореза.
Стоимость зондов:
Предлагаемые нами цены на зонды являются самыми низкими благодаря использованию собственных синтонов – амидофосфитов и CPG флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции.
Компания СИНТОЛ предлагает широкий выбор зондов для ПЦР в реальном времени. Вы можете заказать у нас зонды для работы на любых приборах для ПЦР в реальном времени, с любыми молекулярными вариантами реализации метода (TaqMan Probes, Molecular Beacons, Hybridization Probes, Scorpions Probes и т.д.)
Вернуться в раздел