Нужна ли очистка олигонуклеотидов
![НУЖНА ЛИ ОЧИСТКА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ: Какой процент примесей содержится в неочищенном олигонуклеотиде? oligonukleotidi.jpg](/upload/medialibrary/a10/a1043942abb7f7530148165bf7d666fa.jpg)
Синтез олигонуклеотидов осуществляется на автоматическом синтезаторе амидофосфитным методом. Суть метода заключается в последовательном наращивании олигонуклеотидной цепи соответствующим активированным мономером. Уровень чистоты целевого олигонуклеотида определяется эффективностью присоединения мономера к полинуклеотидной цепи на каждой стадии синтеза.
Амидофосфитный метод позволяет проводить конденсацию на каждой стадии в среднем на 98.5%. Таким образом, для N-звенного олигонуклеотида необходимо провести N циклов присоединения нуклеотида к растущей олигонуклеотидной цепи, а значит, конечный выход продукта будет равен:
![formul1.gif formul1.gif](/upload/medialibrary/bb4/bb4ada388b376fe39cf66eacf5bcb71b.gif)
ПОМНИТЕ! Чем длиннее Ваш олигонуклеотид, тем более необходима его очистка.
Какой уровень чистоты олигонуклеотида необходим для вашей работы?
![НУЖНА ЛИ ОЧИСТКА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ? oligonukleotidi-2.jpg](/upload/medialibrary/c74/c74adb46474d540bb36c4cb867697542.jpg)
Основная цель очистки заключается в удалении образующихся в процессе синтеза укороченных последовательностей и выделении олигонуклеотида целевой длины. "Синтол" для очистки олигонуклеотидов использует гель-электрофорез или ВЭЖХ.
Условия очистки подобраны в соответствии с длиной, последовательностью и природой олигонуклеотида для обеспечения максимального разделения продуктов синтеза. Мы можем гарантировать 90-98% чистоты для всех олигонуклеотидов, которые Вы заказываете у нас.
Таким образом, для того, чтобы выбрать между неочищенным или очищенным олигонуклеотидом, необходимо знать, как повлияет примесь укороченных последовательностей на прецизионность эксперимента.
Здесь приведены некоторые данные, связанные с выбором уровня чистоты олигонуклеотида, допустимого для разного рода экспериментов.
![tabl_ochistka.jpg tabl_ochistka.jpg](/upload/medialibrary/d79/d796b6787a594adc15ec9f2d0dd84050.jpg)
ПОМНИТЕ! Успех Вашего эксперимента в значительной степени определяется чистотой используемых олигонуклеотидов.
Очистка олигонуклеотидов с помощью гель-электрофореза
![oligonukleotidi-10.jpg oligonukleotidi-10.jpg](/upload/medialibrary/a08/a08c854504d9f7e23fc2b9c70b7d76d7.jpg)
Разделение олигонуклеотидов под действием электрического тока происходит в зависимости от молекулярного веса и длины образца. При этом олигонуклеотиды, содержащие так называемые мигающие нуклеотиды, в процессе гель-электрофореза не разделяются.
Препаративная электрофоретическая очистка олигонуклеотидов производится в 10-20% полиакриламидном геле в зависимости от длины олигонуклеотида, т.е. в условиях максимального разделения продуктов синтеза. Разделение ведется в денатурирующих условиях (7 М мочевина) для того, чтобы предотвратить образование олигонуклеотидом вторичных структур. Разделение в присутствие маркеров длин позволяет точно идентифицировать олигонуклеотиды целевой длины.
Визуализация геля производится на ТСХ пластине под УФ-лампой. Этот метод детекции позволяет различить олигонуклеотиды, количества которых превышают 0.1 ое.
Олигонуклеотид целевой длины вырезается из геля, выделяется и обессоливается. Измерение концентрации олигонуклеотида производится с использованием двулучевого УФ-спектрофотометра при длине волны 260 нм в области максимального поглощения олигонуклеотида.
Электрофоретическая очистка олигонуклеотидов позволяет достигнуть 95-99% чистоты для коротких олигонуклеотидов (<25 звеньев) и 85-90% - для длинных (>30 звеньев).
ПОМНИТЕ!
- Очистка в ПААГ может быть использована только для небольших количеств олигонуклеотидов (до 10 ое).
- Олигонуклеотиды, содержащие большое количество гуанина, склонны к образованию высоко стабильных вторичных структур, не разрушающихся даже в 7М мочевине, и поэтому эффективность очистки для таких G-богатых олигонуклеотидов значительно снижается.
Очистка олигонуклеотидов с помощью ВЭЖХ
![Очистка олигонуклеотидов с помощью ВЭЖХ oligonukleotidi-11.jpg](/upload/medialibrary/fe0/fe07d109d4b8a1a0fb9527e1a6146d25.jpg)
Принцип метода основан на разделении молекул различной гидрофобности, содержащих и не содержащих диметокситритильную группу. Хроматографическая колонка с гидрофобным носителем адсорбирует оба типа молекул. Однако более гидрофобные молекулы удерживаются на колонке дольше, чем менее гидрофобные при элюции градиентом буфера.
После выделения целевого олигонуклеотида диметокситритильная группа удаляется, а олигонуклеотид обессоливается. Чистота хроматографически очищенного олигонуклеотида подтверждается далее с помощью аналитического гель-электрофореза.
Обращенно-фазовая ВЭЖХ позволяет получить большие количества очищенных олигонуклеотидов. При этом возможная степень очистки составляет 90-95%. Вместе с тем, при очистке олигонуклеотидов, длина которых превышает 50 звеньев, эффективность разделения продуктов синтеза может значительно снижаться.
ПОМНИТЕ! G-богатыми олигонуклеотиды, склонные к образованию высокостабильных вторичных структур, не могут быть выделены с помощью этого метода.
Вернуться в раздел